3-磷酸甘油酸激酶（3-Phosphoglycerate kinase，PGK）试剂盒说明书

微量法 100T/96S

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的关键酶，广泛存在于动植物和微生物体内，催化 1，3-二磷酸甘油酸转变为 3-磷酸甘油酸，产生 1 分子ATP，具有影响 DNA 复制和修补及刺激病毒 RNA 合成等生物学功能，广泛应用于药物靶标设计。

测定原理：

3-磷酸甘油酸激酶催化 3-磷酸甘油酸和ATP 产生 1,3-二磷酸甘油酸和ADP，1,3-二磷酸甘油酸在 3-磷酸甘油醛脱氢酶和 NADH 作用下产生 3-磷酸甘油醛、NAD 和磷酸，340nm 处的吸光度变化反映了 3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。

3-磷酸甘油酸激酶试剂盒   光合系列

组成：

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 2ml 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂三：粉剂×1 支，-20℃避光保存。临用前加 1ml 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂四：粉剂×1 支，-20℃避光保存。临用前加 1 ml 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂五：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 4 ml 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

自备仪器和用品：

天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板。

酶液提取：

①总 PGK 酶提取：建议称取约 0.1g 样本，加入 1ml 提取液，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃，500g 离心 5min，取上清测定。

②胞浆和叶绿体 PGK 酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5～10 的比例（建议称取约 0.1g 样本，加入 1ml 提取液），冰浴匀浆后于 4℃，500g 离心 5min，弃沉淀，取上清在 4℃，8000g离心 10min，取上清用于测定胞浆 PGK 酶活性，取沉淀加 1ml 提取液，震荡溶解后超声破碎（冰浴， 200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃，500g 离心 5min，取上清测定叶绿体中 PGK 酶活性。

建议测定总 PGK 酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 PGK，则按照步骤②提取粗酶液。

测定操作：

1、分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

1. 取微量石英比色皿/96 孔板，依次加入 100μl 试剂一，20μl 试剂二，10μl 试剂三，10μl 试剂四，40μl试剂五，20μl 粗酶液，充分混匀，记录 340nm 处 10s 的吸光值A1 和 310s 的吸光值A2，△A=A1-A2

计算公式：

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1） 按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

PGK（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

（2） 按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

PGK（nmol/min /g 鲜重）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=321.54×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，0.2ml；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm； V 样：加入样本体积，0.02ml；V 样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g

b. 用 96 孔板测定的计算公式如下

（1） 按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

PGK（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T=643.08×ΔA÷Cpr

（2） 按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

PGK（nmol/min /g 鲜重）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=643.08×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，0.2ml；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，0.5cm； V 样：加入样本体积，0.02ml；V 样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g

3-磷酸甘油酸激酶试剂盒   光合系列