滤纸酶（Filter paper Activity，FPA）试剂盒说明书

分光光度法 50 管/24 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

纤维素酶是由微生物产生的多组分的酶系，能水解纤维素β-1,4 葡萄糖苷键生成葡萄糖，研究滤纸酶活力对纤维素酶的研究具有非常重要的意义。

测定原理：

滤纸酶水解滤纸产生的还原糖能与 3,5-二硝基水杨酸生成红棕色氨基化合物，在 540nm 处有最大光吸收，在一定范围内反应液颜色深浅与还原糖的量成正比，可测定计算得滤纸酶的活力。

滤纸酶试剂盒   糖代谢系列-常备现货

组成：

自备仪器和用品：

天平、研钵、低温离心机、可见分光光度计、1 ml 玻璃比色皿、恒温水浴锅。

酶液提取：

1. 组织：按照质量（g）：蒸馏水体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g，加入 1ml 蒸馏水）加入蒸馏水，冰浴匀浆后于 4℃，12000rpm 离心 10min，取上清置于冰上待测。

2. 细胞：按照细胞数量（10⁴ 个）：蒸馏水体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1ml提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 4℃，12000rpm离心 10min，取上清置于冰上待测。

3. 培养液或其它液体：直接检测。

测定操作：

1. 根据样本数量取两倍数量的滤纸条和 Ep 管，每支Ep 管中放入一个卷状滤纸条（注意要放入底部），作为底物。

2. 对照管：取 200μl 灭活的酶液，加入 500μl 试剂一，充分混匀，再加入放有滤纸条的 Ep 管中，标注为对照管。

3. 测定管：取 200μl 酶液，加入 500μl 试剂一，充分混匀，再加入放有滤纸条的 Ep 管中，标注为测定管。

4. 对照管和测定管同时置于 50℃水浴锅中反应 30min。

5. 加入 800μl 试剂二，沸水浴 5min，自来水冷却后取 1ml 于 1ml 玻璃比色皿中测定 540nm 处吸光值，分别记为A 对照管和A 测定管。

酶活性计算公式：

标准曲线：y = 0.2805x - 0.0255，R² = 0.9991

（1） 按照蛋白浓度计算

酶活性定义：在 50℃，pH4.6 条件下，每毫克蛋白每分钟分解滤纸产生 1mg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

FPA（U/mg prot）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T

= 0.891×（△A+0.0255）÷ Cpr

（2） 按照样本质量计算

酶活性定义：在 50℃，pH4.6 条件下，每克组织每分钟分解滤纸产生 1mg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

FPA（U/g 鲜重）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V 反总÷（W×V 样÷V 样总）÷T

= 0.891×（△A+0.0255）÷ W

（3） 按液体体积计算

酶活性定义：在 50℃，pH4.6 条件下，每毫升培养液每分钟分解滤纸产生 1mg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

FPA（U/ml）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V 反总÷V 样÷T

= 0.891×（△A+0.0255）

（4） 按细胞数量计算

酶活性定义：在 50℃，pH4.6 条件下，每 10⁴ 个细胞每分钟分解滤纸产生 1mg 葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。

FPA（U/10⁴cell）=（△A+0.0255）÷ 0.2805×V 反总÷（V 样×细胞数量（万个）÷V 样总）÷T

= 0.891×（△A+0.0255）÷ 细胞数量（万个）

V 反总：反应总体积，1.5ml，V 样：反应体系中加入样本体积，0.2ml；V 样总：加入提取液体积，1ml；

Cpr：样本蛋白浓度，mg/ml；W：样本质量，g；T：反应时间，30min

注意事项：

1. 用干净的镊子取出滤纸条，带手套卷成卷放入Ep 管底部。

2. 样本灭活时保证同一批样本处理时间一致，建议沸水浴十分钟。

3. 批量样本测定之前先做 1-2 个样本的预实验，若吸光值超过 1.2，建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定，计算公式中乘以稀释倍数。

4. 显色后取检测液时注意枪头不要碰到滤纸条，以免带入毛状物，影响测定结果。

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