单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）活性测定试剂盒说明书

微量法 100T/96S

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

MDHAR 催化MDHA 还原生成AsA，在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。

测定原理：

MDHAR 催化 NADH 还原MDHA 生成 AsA 和NAD⁺，NADH 在 340 nm 有特征吸收峰，但是 NAD⁺没有。通过测定 340 nm 光吸收下降速率，来计算出MDHAR 活性。

单脱氢抗坏血酸还原酶活性测定试剂盒

组成：

试剂三：粉剂×1 瓶（棕色），4℃保存。临用前加入 3 ml 蒸馏水充分溶解。试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 2.5 ml 蒸馏水充分溶解。

试剂五：液体 15μl×1 瓶，4℃保存。临用前加 3 ml 试剂二充分溶解。

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

自备仪器和用品：

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、可调式移液枪和双蒸水

粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

2. . 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1ml 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；8000g ， 4℃离心 20min，取上清液置冰上混匀待测。

3. 血清等液体：直接测定。

MDHAR 测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 340 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。

3. 依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μl 试剂三、20μl 试剂四、20μl 试剂五和 120μl 试剂二，最后加入 20μl 上清液，迅速混匀后于 340nm 比色，记录 30s 和 150s 的吸光值 30s 和 150s 的吸光值A1 和A2，△ A=A1-A2。

MDHAR 活性计算公式：

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹]÷（Cpr×V 样）÷T

= 804×△A ÷Cpr

(2). 按样本质量计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化 1nmol NADH 为 1U。 MDHAR (nmol/min /g 鲜重) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹]÷（W×V 样÷V 样总）÷T= 804×△A ÷W

（3） 按细胞数量计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每 10⁴ 个细胞每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

MDHAR (nmol/min/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷（细胞数量×V 样÷V 样总）÷T

= 804×△A ÷ 细胞数量

（4） 按液体体积计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每毫升液体每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

MDHAR (nmol/min /ml) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷V 样）÷T= 804×△A

ε：NADH 摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，0.2ml=2×10^-4L； V 样：加入反应体系中上清液体积，20μl=0.02ml；V 样总：提取液体积，1 ml；Cpr：上清液蛋白浓度， mg/ml，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司蛋白质含量BCA 试剂盒；W ：样品质量；T：反应时间，2min。

b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下：

(1). 按蛋白浓度计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹]÷（Cpr×V 样）÷T

= 1608×△A ÷Cpr

(2). 按样本质量计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化 1nmol NADH 为 1U。 MDHAR (nmol/min /g 鲜重) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹]÷（W×V 样÷V 样总）÷T= 1608×△A ÷W

（3） 按细胞数量计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每 10⁴ 个细胞每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

MDHAR (nmol/min/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷（细胞数量×V 样÷V 样总）÷T

= 1608×△A ÷ 细胞数量

（4） 按液体体积计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每毫升液体每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

MDHAR (nmol/min /ml) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷V 样）÷T

=1608×△A

ε：NADH 摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 反总：反应体系总体积，0.2ml=2×10^-4L； V 样：加入反应体系中上清液体积，20μl=0.02ml；V 样总：提取液体积，1 ml；Cpr：上清液蛋白浓度， mg/ml，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司蛋白质含量 BCA 试剂盒；W ：样品质量；T：反应时间，2min。

注意事项：

临用前配制的试剂未使用完的 4℃保存，3 天内使用完。

单脱氢抗坏血酸还原酶活性测定试剂盒