抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定试剂盒说明书

微量法 100T/96S

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

APX 是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。APX 具有多种同功酶，分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体，以及过氧化体和类囊体膜上。APX 催化 H2O2 氧化AsA，是植 AsA 的主要消耗者。APX 的活性直接影响到AsA 的含量，APX 与AsA 具有一定的负相关性。

测定原理：

APX 催化H2O2 氧化AsA，通过测定AsA 氧化速率，来计算得 APX 活性。

抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定试剂盒

组成：

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 3 ml 蒸馏水充分溶解。

自备仪器和用品：

低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、移液枪、研钵、冰和蒸馏水。

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

粗酶液提取：

按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 试剂一）进行冰浴匀浆。13000g，4℃离心 20min，取上清置冰上待测。

测定：

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上，调节波长到 290nm，用蒸馏水调零。

2. 试剂一在 25℃中预热 30min。

3. 依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μl 上清液、140μl 预热的试剂一 20μl 试剂二和 20μl 试剂三，迅速混匀后在 290nm 测定 10s 和 130s 光吸收A1 和A2，△A=A1-A2。

APX 活性计算：

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1) 按样本蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

APX(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d）×V 反总×10⁹÷(Cpr×V 样)÷T

=1786×△A÷ Cpr

（2）按样本质量计算

活性单位定义：每g 组织每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

APX(nmol/min/g 鲜重 ) = △A÷(ε×d）×V 反总×10⁹÷(W×V 样÷V 样总)÷T

=1786×△A ÷W

ε：AsA 在 290nm 处摩尔吸光系数为 2.8×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径（cm），1 cm；V 反总：反应体系总体积（L），200μl=2×10^-4 L；10⁹：1mol=1×10⁹nmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/ml），需要另外测 定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V 样：加入反应体系中上清液体积（ml）， 20μl=0.02ml；V 样总：提取液体积，1 ml；T：催化反应时间（min），2min。

b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下

(1) 按样本蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

APX(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d）×V 反总×10⁹÷(Cpr×V 样)÷T

=3571×△A÷ Cpr

（2）按样本质量计算

活性单位定义：每g 组织每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

APX(nmol/min/g 鲜重) = △A÷(ε×d）×V 反总×10⁹÷(W×V 样÷V 样总)÷T

=3571×△A ÷W

ε：AsA 在 290nm 处摩尔吸光系数为 2.8×10³ L/mol/cm；d：96 孔板光径（cm），0.5 cm；V 反总：反应体系总体积（L），200μl=2×10^-4 L；10⁹：1mol=1×10⁹nmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/ml），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V 样：加入反应体系中上清液体积

（ml），20μl=0.02ml；V 样总：提取液体积，1 ml；T：催化反应时间（min），2min。

注意事项：

配制好的试剂二 4℃保存，并且 3 天内使用完。

抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定试剂盒