抗坏血酸氧化酶（ascorbate oxidase，AAO）活性测定试剂盒说明书

微量法 100T/96S

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

AAO 是定位于植物细胞壁的糖蛋白，属“蓝铜氧化酶"家族。细胞壁内的抗坏血酸和AAO 与细胞壁的代谢和生长有着密切的联系。AAO 氧化 AsA 所形成的 MDHA 可通过质膜上的细胞色素b 还原，该过程中电子的跨膜运输能够促进细胞生长。

测定原理：

AAO 可直接氧化AsA，通过测定AsA 的氧化量，可计算得 AAO 活力。

抗坏血酸氧化酶活性测定试剂盒-常备现货

组成：

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 2ml 蒸馏水充分溶解。

自备仪器和用品：

低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、可调式移液器、研钵、冰、蒸馏水。

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

粗酶液提取：

按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 试剂一）进行冰浴匀浆。16000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

AAO 测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 265 nm。

2. 试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。

3. 依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μl 上清液、170μl 预热的试剂二和 10μl 试剂三，迅速混匀后在265nm 测定 10s 和 130s 光吸收A1 和A2，△A =A1-A2。

AAO 活性计算公式：

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

AAO 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V 反总×10⁹÷(Cpr×V 样)÷T

= 92.4×△A÷Cpr

(2). 按样本质量计算

AAO 活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

AAO(nmol/min/g 鲜重) = △A÷(ε×d）×V 反总×10⁹÷(W×V 样÷V 样总)÷T

= 92.4×△A÷W

ε：AsA 在 265nm 处摩尔吸光系数为 5.42×10⁴ L/mol/cm；d：比色皿光径（cm），1 cm； V 反总：反应体系总体积（L），200μl=2×10^-4 L；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/ml），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V 样：加入反应体系中上清液体积

（ml），20μl=0.02 ml；V 样总：提取液体积，1ml； T：催化反应时间（min），2min。

b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

AAO 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V 反总×10⁹÷(Cpr×V 样)÷T

=184.8×△A÷Cpr

(2). 按样本质量计算

AAO 活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

AAO(nmol/min/g 鲜重) = △A÷(ε×d）×V 反总×10⁹÷(W×V 样÷V 样总)÷T

= 184.8×△A÷W

ε：AsA 在 265nm 处摩尔吸光系数为 5.42×10⁴ L/mol/cm；d：96 孔板光径（cm），0.5 cm； V 反总：反应体系总体积（L），200μl=2×10^-4 L；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/ml），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质量；V 样：加入反应体系中上清液体积（ml），20μl=0.02 ml；V 样总：提取液体积，1 ml；

T：催化反应时间（min），2min。

注意事项:

配制好的试剂放在 4℃保存，三天内使用完。

抗坏血酸氧化酶活性测定试剂盒-常备现货