L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶（Gal LDH）活性测定试剂盒说明书

微量法 100T/96S

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

L-半乳糖途径是合成AsA 的主要途径。Gal LDH 位于线粒体内膜，负责催化植物体内 AsA 生物合成的最后一步，也是该途径的关键酶之一，对植物体内AsA 含量的积累起着至关重要的作用。

测定原理：

Gal LDH 催化L-半乳糖内酯还原细胞se素C(Cyt c)，还原型 Cyt c 在 550nm 有吸收峰；测定还原型 Cyt c 增加速率，来计算Gal LDH 活性。

L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶活性测定试剂盒

组成：

试剂二：粉剂×1 瓶（棕色），4℃保存。临用前加入 16ml 蒸馏水，充分溶解。试剂三：粉剂×1 管，4℃保存。临用前加入 2ml 蒸馏水，充分溶解。

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

自备仪器和用品：

台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。

粗酶液提取：

照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 试剂一）进行冰浴匀浆。13000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

Gal LDH 测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 550nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。

3. 依次在、微量玻璃比色皿/96 孔板中加入 20μl 上清液、160μl 预热的试剂二和 20μl 试剂三，迅速混匀后于 550nm 比色，记录 10s 和 130s 的吸光值A1 和A2，△A = A2﹣A1。

Gal LDH 活性计算公式：

使用 96 孔板测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

Gal LDH 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原 1nmol Cyt c 为 1 个酶活单位。

Gal LDH (nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷（Cpr×V 样）÷T

=578×△A ÷Cpr

(2). 按样本质量计算

Gal LDH 活性单位定义：25℃中每克样品每分钟还原 1nmol Cyt c 为 1 个酶活单位。

Gal LDH (nmol/min/g 鲜重) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷（W×V 样÷V 样总）÷T

=578×△A ÷W

ε：还原型 Cyt c 摩尔消光系数，17.3×10³L/ mol/cm；d：96 孔板光径(cm)，0.5cm；V 反总：反应体系总体积，0.2ml=0.0002 L；10⁹：1mol=1×10⁹nmol；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μl=0.02ml；V 样总：提取液体积，1 ml；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/ml，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司蛋白质含量BCA 试剂盒；T：反应时间，2min。

注意事项:

试剂二和试剂三配制好后 3 天内使用完。

L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶活性测定试剂盒