脱氢抗坏血酸（dehydroascorbate，DHA）含量测定试剂盒说明书

微量法 100T/96S

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

AsA 作为植物细胞一个重要生理指标，其 AsA 的含量、氧化还原状态(AsA/DHA 比率)及其合成与代谢相关酶类活性的变化涉及植物对一系列环境胁迫的响应。DHA 是AsA 的可逆的氧化型，在生物体内，与抗坏血酸共同组成氧化还原系统，具有电子受体的作用。

测定原理：

DTT 还原DHA 生成AsA，通过测定体系中AsA 的生成速率，即可计算出DHA 含量。

脱氢抗坏血酸含量测定试剂盒-常备现货

组成：

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 5ml 蒸馏水充分溶解。

标准品：粉剂×1 瓶， 4℃保存。临用前加入 5.743 ml 蒸馏水充分溶解；吸取 0.1 ml 上述溶液，加入 0.9 ml蒸馏水，混匀，即为 100μmol/L DHA。

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

自备仪器和用品：

低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。

样品中 DHA 提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 试剂一）进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心 20min，取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）：试剂一体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1ml 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；12000g， 4℃离心 10min，取上清液置于冰上待测。

3. 血清等液体：直接测定。

DHA 测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 265 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。

3. 标准管：依次在微量石英比色皿/96 孔板加入 20μl 标准液、160μl 预热的试剂二和 20μl 试剂三，迅速混匀后于 265nm 比色，记录 10s 和 130s 的吸光值A1 和A2，△A 空白管=A2-A1。

4. 测定管：依次在微量石英比色皿/96 孔板加入 20μl 上清液、160μl 预热的试剂二和 20μl 试剂三，迅速混匀后于 265nm 比色，记录 10s 和 130s 的吸光值A3 和A4，△A 测定管=A4-A3。

注意：标准管只需测定一次。

计算公式：

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

DHA(nmol/mg prot) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷（Cpr×V 样）

=100×△A 测定管÷△A 标准管÷Cpr

(2). 按样本质量计算

DHA(nmol/g 鲜重) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷(W×V 样÷V 样总)

=100×△A 测定管÷△A 标准管÷W

(3). 按细胞数量计算

DHA(nmol/10⁴ cell) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷(W×V 样÷V 样总)

=100×△A 测定管÷△A 标准管÷细胞数量

（4）按液体体积计算

DHA(nmol/ml) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷V 样

=100×△A 测定管÷△A 标准管

C 标准液：100μmol/L；V 样总：上清液总体积，1.0 ml=1 ×10^-3 L；V 标准：加入标准品体积，0.02ml；V样：加入样本体积，0.02ml；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/ml；W：样品质量（g）。

b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

DHA(nmol/mg prot) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷（Cpr×V 样）

=100×△A 测定管÷△A 标准管÷Cpr

(2). 按样本质量计算

DHA(nmol/g 鲜重) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷(W×V 样÷V 样总)

=100×△A 测定管÷△A 标准管÷W

(3). 按细胞数量计算

DHA(nmol/10⁴ cell) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷(W×V 样÷V 样总)

=100×△A 测定管÷△A 标准管÷细胞数量

（4）按液体体积计算

DHA(nmol/ml) =[C 标准液×△A 测定管÷△A 标准管×V 标准]÷V 样

=100×△A 测定管÷△A 标准管

C 标准液：100μmol/L；V 样总：上清液总体积，1.0 ml=1×10^-3 L；V 标准：加入标准品体积，0.02ml；V样：加入样本体积，0.02ml；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/ml；W：样品质量（g）。

注意事项：

1. 临用前配制的试剂未使用完的 4℃保存，3 天内使用完。

2.zui低检出限为 10μmol/L。

脱氢抗坏血酸含量测定试剂盒-常备现货