脱氢抗坏血酸还原酶（dehydroascorbate reductase，DHAR）试剂盒说明书

微量法 100T/96S

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

DHAR 存在于细胞质、线粒体和叶绿体中。DHAR 催化GSH 还原DHA 生成AsA 和GSSG，调控细胞AsA/DHA 比值，是抗坏血酸-谷胱甘tai氧化还原循环的关键酶。提高植物体内的 DHAR 活性，可提高植物食品中AsA 含量，进而提高植物食品的营养品质。

测定原理：

DHAR 催化GSH 还原DHA 生成AsA，通过测定DHA 减少速率，计算 DHAR 活性。

脱氢抗坏血酸还原酶试剂盒-常备现货

组成：

试剂三：粉剂×1 瓶（棕色），4℃保存。临用前加入 2.5 ml 蒸馏水充分溶解。

试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 2.5 ml 蒸馏水充分溶解。

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

自备仪器和用品：

研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、可调式移液器和蒸馏水。

粗酶液提取：

1. 按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）：试剂一体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1ml 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；8000g 4℃离心 20min，取上清液置冰上混匀待测。

3. 血清等液体：直接测定。

DHAR 测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 265nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。

3. 在微量石英比色皿/96 孔板中依次加入 20μl 试剂三、20μl 试剂四和 140μl 试剂二，最后加 20μl 上清液迅速混匀后于 265nm 比色，记录 30s 和 150s 的吸光值A1 和A2，△A=A2-A1。

DHAR 活性计算公式：

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷(Cpr×V 样)÷T

= 92×△A ÷Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义：25℃中每克样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

DHAR(nmol/min/g 鲜重) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷(W×V 样÷V 样总)÷T

= 92×△A ÷W

(3). 按细胞数量计算

活性单位定义：25℃中每 10⁴ 个细胞每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

DHAR(nmol/min/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T

= 92×△A ÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：25℃中每毫升样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

DHAR(nmol/min/ml) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷V 样÷T

= 92×△A

ε ：AsA 在 265nm 处摩尔吸光系数为 5.42×10⁴ L/mol /cm；10⁶：摩尔分子换算成微摩尔分子；d：比色杯光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，0.2ml=2×10^-4 L；V 样：反应体系中加入上清液体积，20μl =0.02ml； V 样总：提取液体积，1 ml；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/ml；W ：样品质量；T：反应时间，2 min。

b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

DHAR(nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷(Cpr×V 样)÷T

= 184×△A ÷Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义：25℃中每克样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

DHAR(nmol/min/g 鲜重) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷(W×V 样÷V 样总)÷T

= 184×△A ÷W

(3). 按细胞数量计算

活性单位定义：25℃中每 10⁴ 个细胞每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

DHAR(nmol/min/10⁴ cell) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T

= 184×△A ÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：25℃中每毫升样本每分钟还原生成 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。

DHAR(nmol/min/ml) = △A÷ε÷d×V 反总×10⁹÷V 样÷T

= 184×△A

ε ：AsA 在 265nm 处摩尔吸光系数为 5.42×10⁴ L/mol /cm；10⁶：摩尔分子换算成微摩尔分子；d：96 孔板 光径，0.5 cm；V 反总：反应体系总体积，0.2ml=2×10^-4 L；V 样：反应体系中加入上清液体积，20μl =0.02ml； V 样总：提取液体积，1 ml；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/ml；W ：样品质量；T：反应时间，2 min。

注意事项：

临用前配制的试剂未使用完的 4℃保存，3 天内使用完。

脱氢抗坏血酸还原酶试剂盒-常备现货