二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）试剂盒说明书

微量法 100 管/96 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

二磷酸核酮糖羧化酶（EC 4.1.1.39）是植物光合作用中的一个关键酶，既控制着CO2 的固定，同时又制约着碳素向Calvin 循环和光呼吸循环分流，其活性的大小直接影响着光合速率。

测定原理：

在Rubisco 的催化下，1 分子的核酮糖-1，5-二磷酸（RuBP）与 1 分子的CO2 结合，产生 2 分子的 3-磷酸甘油酸（PGA），PGA 可通过外加的 3-磷酸甘油酸激酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶的作用，产生甘油醛-3-磷酸，并使还原型辅酶 I（NADH）氧化。因此，340nm 吸光度的变化可计算还原型辅酶I 氧化速率，还原型辅酶I 氧化速率可反应Rubisco 的活性。

二磷酸核酮糖羧化酶试剂盒   光合系列

组成：

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 10ml 试剂一，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 10ml 试剂一，充分混匀待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 1 ml 试剂一，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

（注意：试剂二、三、四溶解后，按需分装-20℃保存。）自备仪器和用品：

分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

粗酶液制备：

①总Rubisco 酶提取：建议称取约 0.1g 样本，加入 1ml 提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃，8000g 离心 10min，取上清测定。

②胞浆和叶绿体Rubisco 酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5～10 的比例（建议称取约 0.1g 样本，加入 1ml 提取液一），冰浴匀浆后于 4℃，200g 离心 5min，弃沉淀，取上清在 4℃， 8000g 离心 10min，取上清用于测定胞浆 Rubisco 酶活性，取沉淀加 1ml 提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃，8000g 离心 10min，取上清测定叶绿体中Rubisco 酶活性。

建议测定总Rubisco 酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 Rubisco，则按照步骤②提取粗酶液。

（注意：粗酶液制备过程中超声破碎操作使用细胞破碎仪进行。）测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

(1) 工作液的配制：临用前将试剂二和试剂三 1：1 混合，用多少配多少；

(2) 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10uL 样本、10uL 试剂四和 180uL 工作液，混匀，立即记录 340nm处 20s 时吸光值A1 和 5min20s 时的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

Rubisco 活性计算：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

1、按样本蛋白浓度计算

单位的定义：25℃中 1 mg 蛋白 1 min 氧化 1 nmol NADH。

Rubisco（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T =643×ΔA÷Cpr 此法需要测定粗酶液中蛋白质浓度，建议选购本公司生产的BCA 蛋白质浓度测定试剂盒。 2、按样本鲜重计算

单位的定义：25℃中 1 g 组织 1 min 氧化 1nmol NADH。

Rubisco（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=643×ΔA÷W

上述计算公式中各符合含义：

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm； V 样：加入样本体积，0.01 ml；V 样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，5min；W：样本质量，g。 b.使用 96 孔板测定的计算公式如下：

1、按样本蛋白浓度计算

单位的定义：25℃中 1 mg 蛋白 1 min 氧化 1 nmol NADH。

Rubisco（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T =1286×ΔA÷Cpr此法需要测定粗酶液中蛋白质浓度，建议选购本公司生产的BCA 蛋白质浓度测定试剂盒。 2、按样本鲜重计算

单位的定义：25℃中 1 g 组织 1 min 氧化 1nmol NADH。

Rubisco（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=1286×ΔA÷W

上述计算公式中各符合含义：

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；

V 样：加入样本体积，0.01ml；V 样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，5 min；W：样本质量，g。

二磷酸核酮糖羧化酶试剂盒   光合系列