乙酰fu酶A（Acetyl-CoA）含量测定试剂盒说明书

微量法 100 管/96 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

乙酰付、酶A 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。是生物体能源物质代谢过程中产生的一种重要的中间代谢产物。在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质。糖、脂肪、蛋白质三大营养物质通过乙酰fu酶A 汇聚成一条共同的代谢通路-三羧酸循环和氧化磷酸化，经过这条通路che底氧化生成二氧化碳和水，释放能量用于 ATP 合成。此外，乙酰fu酶 A 是合成脂肪酸，酮体，胆gu醇及其衍生物等生理活性物质的前体物质。

测定原理：

苹果酸脱氢酶可催化苹果酸和 NAD 生成草酰乙酸和NADH。柠檬酸合酶可催化乙酰fu酶 A 和草酰乙酸生成柠檬酸和fu酶 A。利用苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶的偶联反应，乙酰fu酶 A 含量和NADH 的生成速率成正比，340nm 下吸光值的上升速率反应了乙酰fu酶 A 含量的高低。

乙酰fu酶A含量测定试剂盒   三羧酸循环系列

组成：

试剂二：粉剂×1 支，-20℃保存。临用前加入 250μl 试剂五充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂三：液体 10uL×1 支，4℃保存。临用前加入 250μl 试剂五充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃保存。临用前加入 22.5ml 试剂五充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

工作液的配制：临用前请根据拟用工作液体积（样本数×0.23 ml），将试剂二、三和四按照 1:1:90 的比例混合，或者直接把试剂二和试剂三加入到试剂四中混匀（可以测定 96 样）；加样前置 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴锅中预热 30 min；现配现用；

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

自备仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

乙酰fu酶 A 的提取：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：试剂一体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1ml 试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 试剂一），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热 30min，用蒸馏水于 340nm 处调零。

2、将工作液置 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴锅中预热 10 min。

2、取 25μl 样本和 230μl 工作液至微量石英比色皿或者 96 孔板，混匀，立即记录 340nm 处 20s 的吸光值A1 和 80s 时的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

乙酰fu酶 A 含量计算：

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

标准条件下测定的回归方程为y = 1640x + 0.012；x 为吸光值，y 为标准品浓度（nmol/ml）。

注意：本试剂盒zui低检测限为 1.6nmol/ml。

（1） 按照蛋白浓度计算

乙酰fu酶A 含量(nmol/mg prot)=[(1640×ΔA＋0.012) ×V1]÷(V1×Cpr)=(1640×ΔA＋0.012) ÷Cpr

需要另外测定，建议使用本公司BCA 蛋白质含量测定试剂盒。

（2） 按照样本质量计算

乙酰fu酶A 含量(nmol/g 鲜重)=[(1640×ΔA＋0.012) ×V1]÷(W×V1÷V2)=(1640×ΔA＋0.012) ÷W

(3 ) 按照细菌或细胞密度计算：

乙酰fu酶A 含量(nmol/10⁴)=[(1640×ΔA＋0.012)×V1]÷(500×V1÷V2)=(1640×ΔA＋0.012)÷500

V1：加入反应体系中样本体积，0.025ml；V2：加入提取液体积，1 ml；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。

b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下：

标准条件下测定的回归方程为y = 3280x + 0.024；x 为吸光值，y 为标准品浓度（nmol/ml）。

注意：本试剂盒zui低检测限为 1.6nmol/ml。

（1） 按照蛋白浓度计算

乙酰fu酶A 含量(nmol/mg prot)=[(3280×ΔA＋0.024) ×V1]÷(V1×Cpr)=(3280×ΔA＋0.024) ÷Cpr

需要另外测定，建议使用本公司BCA 蛋白质含量测定试剂盒。

（2） 按照样本质量计算

乙酰fu酶A 含量（nmol/g 鲜重）=[(3280×ΔA＋0.024) ×V1]÷(W×V1÷V2)=(3280×ΔA＋0.024) ÷W

(3 ) 按照细菌或细胞密度计算：

乙酰fu酶A 含量（nmol/10⁴）=[(3280×ΔA＋0.024)×V1]÷(500×V1÷V2)=(3280×ΔA＋0.024)÷500

V1：加入反应体系中样本体积，0.025ml；V2：加入提取液体积，1 ml；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。

乙酰fu酶A含量测定试剂盒   三羧酸循环系列