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亚硝酸还原酶（Nitrite reductase，NiR）试剂盒说明书
微量法 100T/48S
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
硝酸还原酶（NiR）是一类能催化亚硝酸盐还原的mei，广泛存在于微生物及植物体内，是自然界氮循环过程中的关键酶，可以将亚硝酸盐降解为 NO 或NH3，从而减少环境中亚硝态氮的积累，降低因亚硝酸盐累积而造成的对生物体的毒害作用。
亚硝酸还原酶可将NO2—还原为NO，使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的 NO —减少，即540nm 处吸光值的变化可反映亚硝酸还原酶的活性。
产品名称 | BG6022-100T/48S | Storage |
提取液：液体 | 112ml | 4℃ |
试剂一：液体 | 4ml | 4℃ |
试剂二：粉剂 | 1 瓶 | 4℃ |
试剂三：液体 | 5ml | 4℃ |
试剂四：液体 | 10ml | 4℃避光 |
试剂五：液体 | 10ml | 4℃避光 |
说明书 | 一份 | |
试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 5ml 蒸馏水溶解。
试剂三：液体 5ml×1 瓶，4℃保存。（如出现沉淀可以 70-80℃加热溶解）
试剂四：液体 10ml×1 瓶，4℃避光保存。（如出现沉淀可以 70-80℃加热溶解）工作液：临用前根据用量将试剂四和试剂五以 1:1 的比例混合。
具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准
天平、研钵、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、水浴锅、低温离心机。
1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1ml 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g， 4℃离心 10min，取上清置于冰上待测。
空白管 | 对照管 | 测定管 | |
样本（μl） | 20 | 20 | |
蒸馏水（μl） | 20 | 40 | |
试剂一（μl） | 40 | 40 | |
试剂二（μl） | 40 | 40 | 40 |
混匀后，25℃反应 1h | |||
试剂三（μl） | 40 | 40 | 40 |
充分震荡 30S | |||
上清液（μl） | 70 | 70 | 70 |
工作液（μl） | 140 | 140 | 140 |
充分混匀，，静置 3min 后测定各管 540nm 处吸光值，分别记为A 空 白管、A 对照管、A 测定管。空白管只要做一管，每个测定管需设一个对照管。 | |||
计算公式：
标准曲线：y = 1.3594x + 0.0072，R2 = 0.9997；x 为标准品浓度（μmol/ml），y 为吸光值（A 标准管-A 空白管）。
1. 按照蛋白含量计算
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每小时还原 1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR（μmol/h /mg prot）= [A 空白管-(A 测定管-A 对照管)-0.0072]÷1.3594×V 标÷（V 样×Cpr）÷T = 1.47×（A空白管-A 测定管+A 对照管-0.0072）÷Cpr
2. 按照样本质量计算
酶活单位定义：每克组织每小时还原 1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR（μmol/h/g 鲜重）=[A 空白管-(A 测定管-A 对照管)-0.0072]÷1.3594×V 标÷（W ×V 样÷V 样总）÷T = 1.47×（A 空白管-A 测定管+A 对照管-0.0072）÷W
3. 按照细胞数量计算
酶活单位定义：每 104 个细胞每小时还原 1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR（μmol/h /104 cell）= [A 空白管-(A 测定管-A 对照管)-0.0072]÷1.3594×V 标÷（细胞数量×V 样÷V 样总）÷T = 1.47×（A 空白管-A 测定管+A 对照管-0.0072）÷细胞数量
V 标：标准液体积，0.04ml；V 样：体系中加入样本体积，0.02ml；V 样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，1h； Cpr：样本蛋白含量；W：样本质量，g
标准曲线：y = 0.6797x + 0.0072，R2 = 0.9997；x 为标准品浓度（μmol/ml），y 为吸光值（A 标准管-A 空白管）。
1. 按照蛋白含量计算
酶活单位定义：每毫克组织蛋白每小时还原 1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR（μmol/h /mg prot）= [A 空白管-(A 测定管-A 对照管)-0.0072]÷0.6797×V 标÷（V 样×Cpr）÷T = 2.94×（A空白管-A 测定管+A 对照管-0.0072）÷Cpr
2. 按照样本质量计算
酶活单位定义：每克组织每小时还原 1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR（μmol/h/g 鲜重）=[A 空白管-(A 测定管-A 对照管)-0.0072]÷0.6797×V 标÷（W ×V 样÷V 样总）÷T = 2.94×（A 空白管-A 测定管+A 对照管-0.0072）÷W
3. 按照细胞数量计算
酶活单位定义：每 104 个细胞每小时还原 1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR（μmol/h /104 cell）= [A 空白管-(A 测定管-A 对照管)-0.0072]÷0.6797×V 标÷（细胞数量×V 样÷V 样总）÷T = 2.94×（A 空白管-A 测定管+A 对照管-0.0072）÷ 细胞数量
V 标：标准液体积，0.04ml；V 样：体系中加入样本体积，0.02ml；V 样总：加入提取液体积，1ml；T：反应时间，1h； Cpr：样本蛋白含量；W：样本质量，g
1. 配制好的工作液 3 天内使用完。
2. 若吸光值超过 1.5，将上清液进行适当的稀释后再加入工作液显色，并在计算公式中乘以稀释倍数。
3. 严格控制显色时间，否则会对结果有影响。
4. 标准曲线线性范围为 0.03μmol/ml-1.5μmol/ml。
5. A 空白管-（A 测定管-A 对照管）线性范围为 0.02-1.5。
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