中性蛋bai酶（Neutral protease, NP）活性测定试剂盒说明书

微量法 100T/48S

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

NP 在一定的温度和中性pH 条件下，催化水解蛋白质。由于其安全无毒、水解能力强、作用范围广等特点，中性蛋bai酶常用于食品、饲料、化妆品和营养保健品生产。

测定原理：

中性条件下，NP 催化酪蛋白水解产生酪an酸；在碱性条件下，酪an酸还原磷钼酸化合物生成钨蓝；在 680nm 有特征吸收峰。

中性蛋bai酶活性测定试剂盒   离子系列

组成：

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 4ml 蒸馏水溶解。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。临用前加入 10ml 试剂一，沸水浴中磁力搅拌溶解。（可在烧杯上盖一层保鲜膜，注意观察，避免水分全部蒸发，一般加热 15-30 分钟，该试剂为过饱和试剂，充分混匀后仍出现颗粒物不溶物不影响使用）。

试剂四：粉剂×1 瓶， 4℃保存。临用前加 20ml 蒸馏水溶解。

标准品：液体 1ml×1 支，0.25μmol/ml 标准酪an酸溶液，4℃保存。

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

自备仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、水浴锅、磁力搅拌器、可调式移液枪、1.5 ml EP管和蒸馏水。

粗酶液提取：

1、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 试剂一）冰浴匀浆，8000g，4℃离心 10min，取上清，即粗酶液。

2、血清或培养液：直接测定。

3、细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1ml 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g， 4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长到 680 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二、试剂三和试剂四置于 30℃水浴保温 30min。

3. 对照管：取 0.5 ml EP 管，加入 20μl 粗酶液，40μl 试剂二，混匀后置于 30℃水浴保温 10min；加入 40μl试剂三，混匀后 8000g，4℃离心 10min；取 40μl 上清液，加入新的EP 管，再加入 200μl 试剂四，40μl 试剂五，混匀后置于 30℃水浴保温 20min，取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板，于 680nm 测定光吸收，记为A 对照管。

4. 测定管：取 0.5 ml EP 管，加入 20μl 粗酶液，40μl 试剂三，混匀后置于 30℃水浴保温 10min；加入 40μl试剂二，混匀后 8000g， 4℃离心 10min；取 40μl 上清液，加入新的EP 管，再加入 200μl 试剂四，40μl试剂五，混匀后置于 30℃水浴保温 20min，取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板，于 680nm 测定光吸收，记为A 测定管。（注意与空白管不同，先加试剂三，后加试剂二）

5. 空白管：取 0.5 ml EP 管，加入 40μl 蒸馏水，200μl 试剂四，40μl 试剂五，混匀后置于 30℃水浴保温 20min，取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板，于 680nm 测定光吸收，记为A 空白管。

6. 标准管：取 0.5 ml EP 管，加入 40μl 标准品，200μl 试剂四，40μl 试剂五，混匀后置于 30℃水浴保温 20min，取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板，于 680nm 测定光吸收，记为A 标准管。

注意：空白管和标准管只需要测定一次。计算公式：

1. 按照样本蛋白浓度计算

NP 活性单位定义：30℃每毫克蛋白每分钟水解产生 1nmol 酪an酸为 1 个酶活单位。

NP 活性（nmol/min /mg prot）= C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×V 反总÷(Cpr×V1)÷T= 125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷Cpr 2．按照样本质量计算

NP 活性单位定义：30℃每克样品每分钟催化水解产生 1 nmol 酪an酸为 1 个酶活单位。

NP 活性（nmol/min /g 鲜重）=C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×V 反总÷（W×V1÷V2）÷T= 125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷W

3. 按照液体体积计算

NP 活性单位定义：30℃每毫升样品每分钟催化水解产生 1nmol 酪an酸为 1 个酶活单位。

NP 活性（nmol/min/ml）=C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×V 反总÷V1÷T= 125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）

1.  按照细胞数量计算

NP 活性单位定义：30℃每 10⁴ 个细胞每分钟催化水解产生 1nmol 酪an酸为 1 个酶活单位。

NP 活性（nmol/min /10⁴ cell）=C 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）×V 反总÷（细胞数量×V1÷V2）÷T= 125×（A 测定管－A 对照管）÷（A 标准管－A 空白管）÷细胞数量

C 标准品：0.25 μ mol/ml 标准酪an酸溶液；V 反总：酶促反应总体积，0.1ml；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/ml）； V1：加入反应体系中粗酶液体积（ml），0.02 ml；V2：提取液总体积（ml），1ml；T：催化反应时间（min）， 10min；W：样品质量（g）。

注意事项：

临用前配制的试剂配制好后 4℃保存，并且 3 天内使用完毕。

中性蛋bai酶活性测定试剂盒   离子系列