磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK)试剂盒说明书

分光光度法 50 管/48 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

PEPCK（EC 4.1.1.32）广泛存在于动物、植物、微生物和细胞中，催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸，是调节糖异生途径的关键酶。

测定原理：

PEPCK 催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和CO2，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化 NADH氧化生成NAD⁺，在 340nm 下测定NADH 下降速率，即可反映 PEPCK 活性。

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组成：

自备仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 μl 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

样本的前处理：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（μl）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1μl 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(μl)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1μl 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、工作液的配制：临用前将试剂二和试剂三转移到试剂一中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3、试剂四的配制：临用前加入 2.5μl 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

4、将工作液和试剂四置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 5 分钟。

5、在 1μl 石英比色皿中加入 50μl 样本、50μl 试剂四和 900μl 工作液，立即混匀，记录 340nm 处初始吸光值A1 和 1min 后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

注意：在该试剂盒中，若ΔA 大于 0.1，需将样本用提取液稀释适当倍数后测定，使ΔA 小于 0.1 可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。

PEPCK 活性计算：

1、血清（浆）PEPCK 活力计算

单位定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCK（nmol/min/μl））＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷V 样÷T=3215×ΔA 2、组织、细菌或细胞中 PEPCK 活力计算

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCK（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=3215×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCK（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=6.43×ΔA

V 反总：反应体系总体积，1×10^-3 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm； V 样：加入样本体积，0.05 μl；V 样总：加入提取液体积，1 μl；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/μl；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

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