莽草酸脱氢酶（Shikimate dehydrogenase，SD）试剂盒说明书

分光光度法 50 管/48 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

莽草酸途径是存在于植物、真菌和微生物中的一条重要的代谢途径，莽草酸脱氢酶是莽草酸合成途径中的关键酶。

测定原理：

莽草酸脱氢酶催化莽草酸和 NADP 产生NADPH，检测 340nm 下的吸光值增加速率来表示 SD 活性。

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试剂组成和配制：

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1ml 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

粗酶液提取：

1、 血清（浆）中 NADP⁺和NADPH 的提取

细菌或培养细胞：

先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（ml）

为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1ml 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：

按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

在试剂二中加入 25ml 试剂一充分溶解混匀，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min，现配现用。

（1） 取 0.05ml 样本和 0.95ml 试剂二于 1ml 比色皿中，混匀，在 340 nm 波长下立即记录 20 秒时的初始吸光度A1 和 5 分 20 秒时的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。

SD 活性计算：

（1） 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 的NADPH 定义为一个酶活力单位。

SD（nmol /min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V×样Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算：

单位的定义：每g 组织每分钟每分钟产生 1 nmol 的NADPH 定义为一个酶活力单位。

SD（nmol /min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=643×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟每分钟产生 1 nmol 的NADPH 定义为一个酶活力单位。

SD（nmol /min /104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=1.286×ΔA

V 反总：反应体系总体积，1×10-3 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.05 ml；V 样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

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