结合态淀粉合成酶（Granule-bound starch synthase，GBSS）试剂盒说明书

微量法 100 管/96 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

GBSS（EC 2.4.1.21）以束缚态存在于淀粉体中，催化淀粉链的加长反应，主要负责直链淀粉的合成。

测定原理：

GBSS 催化ADPG 与淀粉引物(葡聚糖)反应,将葡萄糖分子转移到淀粉引物上，同时生成 ADP；进一步通过反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化 NADP+还原为NADPH，其中NADPH 生成量与前一步反应生成的ADP 数量呈正比，通过 340nm 下测定NADPH 的增加量，可以计算GBSS 活性。

结合态淀粉合成酶试剂盒   淀粉系列

组成：

BM6004-100T/96S 试剂二临用前加入 14ml 试剂一充分混匀备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

BM6004-100T/96S 试剂三临用前加入 8ml 试剂一充分混匀备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

BM6004-100T/96S 试剂四临用前加入 10ml 试剂一充分混匀备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

BM6004-100T/96S 试剂五临用前加入 0.5ml 蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

BM6004-100T/96S 试剂六临用前加入 0.5ml 蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

自备仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

粗酶液制备：

称取 0.1~0.2g 组织（建议称取约 0.1g 组织），加入 1ml 提取液，冰浴中匀浆。10000g ，4℃离心 10min，弃上清，在沉淀中加入 1ml 提取液充分混匀，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、在EP 管中按顺序加入下列试剂

混匀，30℃保温 20 min，置沸水浴中 1 min（盖紧，防止水分散失），冰浴冷却

混匀，30℃保温 30 min，置沸水浴中 1 min（盖紧，防止水分散失），冰浴冷却，10000g 4℃离心 10min，取上清液（如果一次性测定样本较多，可将试剂四、五和六按比例配成混合液）

混匀后立即 340 nm 波长下记录初始吸光度A1 和 2min 后的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。

注意：试剂二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混匀。

GBSS 活性计算：

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

1、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

GBSS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T×稀释倍数

=529×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按照样本鲜重计算

单位的定义：每g 组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

GBSS 活性（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 样÷V 样总）÷T×稀释倍数=529×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，2.6×10^-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径， 1cm；V 样：加入样本体积，0.075 ml；V 样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，2 min；稀释倍数：

1.9；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量。

b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下：

1、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

GBSS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T×稀释倍数

=1059×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按照样本鲜重计算

单位的定义：每g 组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

GBSS 活性（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 样÷V 样总）÷T×稀释倍数 =1059×ΔA÷W V 反总：反应体系总体积，2.6×10^-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：96 孔板光径， 0.5cm；V 样：加入样本体积，0.075 ml；V 样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，2 min；稀释倍数：1.9；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量。

结合态淀粉合成酶试剂盒   淀粉系列