甲基柠檬酸合酶（metheyl-citrate synthase，MCS）试剂盒说明书

分光光度法

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

MCS 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，与柠檬酸合酶（CS）共同参与三羧酸循环的调节。

甲基柠檬酸合酶试剂盒   三羧酸循环系列

测定原理：

MCS 催化丙酰CoA 和草酰乙酸产生甲基柠檬酰fu酶A，进一步水解产生甲基柠檬酸；该反应促使无色的DTNB 转变成黄色的TNB，在 412nm 处有特征吸光值。

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

组成：

BK6011-10T/9S：试剂五：粉剂×1 支，4℃保存，临用前加入 320μl 无水乙醇；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存，临用前加入 320μl 蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂七：粉剂×1 支，-20℃保存，临用前加入 320μl 蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1ml 试剂一和 10μl 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。将匀浆 600g，4℃离心 5min。

弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 CS（此步可选做）。

在步骤④中的沉淀中加入 200μl 试剂二和 2μl 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 CS 测定。

BK6011-25T/24S：试剂五：粉剂×1 支，4℃保存，临用前加入 800μl 无水乙醇；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂六：粉剂×2 支，-20℃保存，临用前加入 400μl 蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂七：粉剂×1 支，-20℃保存，临用前加入 800μl 蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

BK6011-50T/48S：试剂五：粉剂×2 支，4℃保存，临用前加入 800μl 无水乙醇；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂六：粉剂×4 支，-20℃保存，临用前加入 400μl 蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂七：粉剂×2 支，-20℃保存，临用前加入 800μl 蒸馏水；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1ml 玻璃比色皿、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1ml 试剂一和 10μl 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。将匀浆 600g，4℃离心 5min。

弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 CS（此步可选做）。

在步骤④中的沉淀中加入 200μl 试剂二和 2μl 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 CS 测定。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 412nm，蒸馏水调零。

2、将试剂四、五、六和七在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min。

3、样本测定

将上述试剂按顺序加入 1 ml 玻璃比色皿中，加试剂七的同时开始计时，在 412nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度A1 和反应 2min 后的吸光值 A2，计算ΔA=A2-A1。

MCS 活性计算：

（1） 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。 MCS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=1100×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2） 按样本鲜重计算：

单位的定义：每g 组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

MCS（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 样÷V 样总）÷T=222.2×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

MCS（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V 样÷V 样总）÷T=0.4444×ΔA

V 反总：反应体系总体积，9×10^-4 L；ε：TNB 摩尔消光系数，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm； V 样：加入样本体积，0.03 ml；V 样总：加入提取液体积，0.202 ml；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。

甲基柠檬酸合酶试剂盒   三羧酸循环系列