丙酮酸脱氢酶（Pyruvate dehydrogenase，PDH）试剂盒说明书

分光光度法 50 管/48 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

PDH（EC 1.2.4.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶，催化丙酮酸脱梭生成羟yi基-TPP，把糖酵解和三羧酸循环连接起来。

测定原理：

PDH 催化丙酮酸脱氢，同时还原 2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），从而导致 600nm 光吸收的减少。

丙酮酸脱氢酶试剂盒 三羧酸循环系列

组成：

工作液的配制：临用前把试剂五、试剂六、试剂七和试剂八转移到试剂四中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

自备仪器和用品：

可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 ml 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细菌或细胞，加入 1ml 试剂一和 10μl 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、 将匀浆 600g，4℃离心 5min。

3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

4、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 PDH（此步可选做）。

5、 在步骤④的沉淀中加入 200μl 试剂二和 2μl 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 PDH 活性测定。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 605nm 处，蒸馏水调零。

2、工作液于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）中孵育 5min。

3、在 1ml 玻璃比色皿中加入 50μl 样本和 900μl 工作液，混匀，立即记录 605nm 处初始吸光值 A1 和 1min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

PDH 活性计算：

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH 活性（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=905×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每g 组织每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。

PDH 活性（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=182.8×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。 PDH 活性（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.366×ΔA

V 反总：反应体系总体积，9.5×10^-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.05 ml；

V 样总：加入提取液体积，0.202 ml；T：反应时间，1 min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

丙酮酸脱氢酶试剂盒 三羧酸循环系列