乙醇脱氢酶（ADH）活性测定试剂盒说明书

微量法 100T/96S

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

ADH 是生物体内短链醇代谢的关键酶，催化乙醇与乙醛可逆转换，在很多生理过程中起着重要作用。哺乳动物ADH 主要在肝脏生成，肝脏损伤导致ADH 释放到血清中。血清ADH 活性高低反映了肝功能是否异常。

测定原理：

ADH 催化NADH 还原乙醛生成乙醇和NAD⁺，NADH 在 340nm 处有吸收峰，而 NAD⁺没有；测定 340nm吸光度下降速率，来计算ADH 活性。

乙醇脱氢酶活性测定试剂盒 辅酶Ⅰ系列

组成：

试剂三：粉剂×2 瓶，－20℃保存，临用前每瓶加入 9ml 试剂二，现配现用。

自备仪器和用品：

研钵、冰、低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、可调式移液器和蒸馏水。

粗酶液提取：

1、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 试剂一）进行冰浴匀浆。16000g，4℃离心 20min，取上清置冰上待测。

2、细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）：试剂一体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1ml 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；16000g， 4℃离心 20min，取上清液置冰上待测。

3、血清等液体：直接测定。

ADH 测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 340 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂三在 25℃水浴中保温 30 min。

3. 在微量石英比色皿/96 孔板中依次加入 20μl 样本上清液、160μl 试剂三和 20μl 试剂四，迅速混匀后于340nm 测定吸光值变化，分别记录 15s 和 75s 时吸光值，分别记为 A1 和A2。△A 测定管=A1-A2。

计算公式：

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1） 按照蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V 反总×10⁹)÷(Cpr×V 样)÷T

=1608×△A ÷Cpr

（2） 按照样本质量计算

活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

ADH (nmol/min/g 鲜重) =(△A÷ε÷d×V 反总×10⁹)÷(W×V 样÷V 样总)÷T

=1608×△A ÷W

（3） 按细胞数量计算

活性单位定义：25℃中每 10⁴ 个细胞每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

ADH (nmol/min/10⁴cell) = (△A÷ε÷d×V 反总×10⁹) ÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T

=1608×△A ÷细胞数量

（4） 按液体体积计算

活性单位定义：25℃中每毫升血清每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

ADH (nmol/min/ml) =(△A÷ε÷d×V 反总×10⁹) ÷V 样÷T

=1608×△A

ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V 反总：反应体系总体积，200μl=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/ml；W ：样品质量；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μl=0.02 ml； V 样总：提取液体积，1 ml；T：反应时间，1min。

b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下

（1） 按照蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V 反总×10⁹) ÷(Cpr×V 样)÷T

=3215×△A÷Cpr

（2） 按照样本质量计算

活性单位定义：25℃中每克组织每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

ADH (nmol/min/g 鲜重) =(△A÷ε÷d×V 反总×10⁹) ÷(W×V 样÷V 样总)÷T

=3215×△A÷W

（3） 按细胞数量计算

活性单位定义：25℃中每 10⁴ 个细胞每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

ADH (nmol/min/10⁴cell) =(△A÷ε÷d×V 反总×10⁹) ÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T

=3215×△A÷细胞数量

（4） 按液体体积计算

活性单位定义：25℃中每毫升血清每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

ADH (nmol/min/ml) =(△A÷ε÷d×V 反总×10⁹) ÷V 样÷T

=3215×△A

ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5 cm；V 反总：反应体系总体积，200μl=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/ml；W ：样品质量；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μl=0.02 ml； V 样总：提取液体积，1 ml；T：反应时间，1min。

乙醇脱氢酶活性测定试剂盒 辅酶Ⅰ系列