超氧阴离子(Oxygen free radical, OFR)试剂盒说明书

微量法 100T/96S

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

生物体内超氧阴离子等活性氧具有免疫和信号传导的作用，但积累过多时会对细胞膜及生物大分子产生破坏作用，导致机体细胞和组织代谢异常，从而引起多种疾病。

测定原理：

超氧阴离子与盐酸羟胺反应生成 NO2^-，NO2^-在对氨基苯磺酸和α－萘胺的作用下，生成红色的偶氮化 合物，在 530nm 处有特征吸收峰，根据ΔA 值可以计算样品中 O2－含量，反应式为 NH2OH + 2O2^- ＋H ^＋ → NO2^-＋ H2O2 ＋ H2O。

超氧阴离子试剂盒   氧化系列-常备现货

试剂组成和配制：

自备仪器和用品：

天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、氯仿和蒸馏水。

超氧阴离子提取：

1、植物、动物组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 提取液）进行冰浴匀浆，然后，10000g，4℃，离心 20min，取上清置于冰上待测。

2、细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1ml 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g， 4℃，离心 20min，取上清置于冰上待测。

3、血清或培养液：直接测定。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 530nm，蒸馏水调零。

2、加样表

混匀，37℃水浴 20min

混匀，37℃水浴 20min

超氧阴离子含量计算公式：

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.0242x - 0.0027，R²=0.9980

1. 组织：

（1） 按照样本质量计算

超氧阴离子含量（nmol/g 鲜重）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)×2

=148.76×(ΔA+0.0027)÷W

超氧阴离子产生速率（nmol/ g·min）=148.76×(ΔA+0.0027)÷W÷T

=7.44× (ΔA+0.0027)÷W

（2） 按照蛋白质浓度计算

超氧阴离子含量（nmol/mg prot）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V 反总÷(V 样×Cpr)×2

=148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr

超氧阴离子产生速率（nmol/ mg prot·min）= 148.76×(ΔA+0.0027)÷Cpr÷T

=7.44× (ΔA+0.0027)÷Cpr

2. 细菌，真菌：

超氧阴离子含量（nmol/10⁴ cell）= (ΔA+0.0027)÷0.0242× V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)×2

= 148.76×(ΔA+0.0027)÷细胞数量

超氧阴离子产生速率（nmol/10⁴ cell·min）= 148.76×(ΔA+0.0027)÷细胞数量÷T

=7.44× (ΔA+0.0027)÷细胞数量

3. 血清或培养液

超氧阴离子 含量（nmol/ml）= (ΔA+0.0027)÷0.0242×V 反总÷V 样×2

=148.76× (ΔA+0.0027)

超氧阴离子产生速率（nmol/ml·min）= 148.76× (ΔA+0.0027) ÷T

= 7.44× (ΔA+0.0027)

V 样总：加入提取液体积，1 ml； V 反总：反应总体积，0.36ml；V 样：反应中样品体积，0.2ml； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样品质量，g；T：反应时间，20min；2: 2 分子O2－参与反应生成 1分子NO2－。

b. 用 96 孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.0121x - 0.0027，R² = 0.9980

1. 组织：

（1） 按照样本质量计算

超氧阴离子含量（nmol/g 鲜重）= (ΔA+0.0027)÷0.0121×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)×2

=297.52× (ΔA+0.0027)÷W

超氧阴离子产生速率（nmol/ g·min）=297.52× (ΔA+0.0027)÷W÷T

=14.88× (ΔA+0.0027)÷W

（2） 按照蛋白质浓度计算

超氧阴离子含量（nmol/mg prot）= (ΔA+0.0027)÷0.0121×V 反总÷(V 样×Cpr)×2

=297.52× (ΔA+0.0027)÷Cpr

超氧阴离子产生速率（nmol/ mg prot·min）= 297.52× (ΔA+0.0027)÷Cpr÷T

=14.88× (ΔA+0.0027)÷Cpr

2. 细菌，真菌：

超氧阴离子含量（nmol/10⁴ cell）=(ΔA+0.0027)÷0.0121× V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)×2

=297.52× (ΔA+0.0027)÷细胞数量

超氧阴离子产生速率（nmol/10⁴ cell·min）=297.52× (ΔA+0.0027)÷细胞数量÷T

=14.88× (ΔA+0.0027)÷细胞数量

3. 血清或培养液

超氧阴离子 含量（nmol/ml）=(ΔA+0.0027)÷0.0121 ×V 反总÷V 样×2

=297.52×(ΔA+0.0027)

超氧阴离子产生速率（nmol/ml·min）= 297.52×(ΔA+0.0027) ÷T

=14.88×(ΔA+0.0027)

V 样总：加入提取液体积，1 ml； V 反总：反应总体积，0.36ml；V 样：反应中样品体积，0.2ml； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样品质量，g；T：反应时间，20min；2：2 分子O2－参与反应生成 1分子NO2－。

注意事项：

1、OD 值大于 1，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。

2、样品制备好后，立刻进行测定，请勿将样品进行长时间的低温保存，以免影响测定结果。

3、试剂四有一定的毒性，请操作时做好防护措施。

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