乙酰dan碱酯酶（AchE）活性测定试剂盒说明书

微量法 100T/96S

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

AchE 属于丝an酸水解酶，广泛存在于各种动物组织和血清中。AchE 催化乙酰dan碱（Ach）水解，在神经传导调节中起重要作用。

测定原理：

AchE 催化Ach 水解生成dan碱，dan碱与二硫对硝基苯甲酸（DTNB）作用生成 5-巯基-硝基苯甲酸（TNB）； TNB 在 412nm 处有吸收峰，通过测定 412 nm 吸光度增加速率，计算 AchE 活性。

乙酰dan碱酯酶活性测定试剂盒  P450系列

组成：

试剂三：粉剂×1 支，4℃保存。临用前加入 1.3 ml 试剂二，充分震荡溶解。试剂四：粉剂×1 支，4℃保存。临用前加入 1.3 ml 试剂二，充分震荡溶解。

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

自备仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪和蒸馏水。

粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 试剂一）进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心 10min，取上清液待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴ 个）：试剂一体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1ml 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g， 4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体：直接测定。

测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 412 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二置于 37℃水浴中预热 30min。

3. 取微量石英比色皿/96 孔板，依次加入 20μl 上清液、160 μl 试剂二、10μl 试剂三和 10μl 试剂四，迅速混匀，于412nm 处测定3min 内吸光值变化，第10s 吸光值记为A1，第190s 吸光值记为A2。△A 测定管=A2-A1。 AchE 活性计算：

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1. 组织AchE 活性

（1） 按照蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

AchE 酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V 反总×10⁹)÷（Cpr ×V 样）÷T

= 245×△A÷Cpr

（2） 按照样本质量计算

活性单位定义：每克组织每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

AchE 酶活(nmol/min/g 鲜重)= (△A÷ε÷d×V 反总×10⁹)÷（W ×V 样÷V 样总）÷T

= 245×△A÷W

2. 细菌、细胞AchE 活性

活性单位定义：每 10⁴ 个细胞每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

AchE 酶活(nmol/min/10⁴ cell)= (△A÷ε÷d×V 反总×10⁹)÷（细胞数量×V 样÷V 样总）÷T

= 245×△A÷细胞数量

3. 血清AchE 活性

活性单位定义：每毫升血清每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

AchE 酶活(nmol/min /ml)= (△A÷ε÷d×V 反总×10⁹)÷V 样÷T

=245×△A

ε：TNB 摩尔消光系数，13.6×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V 反总：反应体系总体积（L）， 200μl=2×10^-4L；V 样总：提取液体积，1 ml；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；Cpr：蛋白浓度（mg/ml）；V 样：加入上清液体积（ml），0.02 ml；W ：样品质量；T：反应时间（min），3 min。

b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下

1. 组织AchE 活性

（1） 按照蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

AchE 酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V 反总×10⁹)÷（Cpr ×V 样）÷T

= 490×△A÷Cpr

（2） 按照样本质量计算

活性单位定义：每克组织每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

AchE 酶活(nmol/min/g 鲜重)= (△A÷ε÷d×V 反总×10⁹)÷（W ×V 样÷V 样总）÷T

= 490×△A÷W

2. 细菌、细胞AchE 活性

活性单位定义：每 10⁴ 个细胞每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

AchE 酶活(nmol/min/10⁴ cell)= (△A÷ε÷d×V 反总×10⁹)÷（细胞数量×V 样÷V 样总）÷T

= 490×△A÷细胞数量

3. 血清AchE 活性

活性单位定义：每毫升血清每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

AchE 酶活(nmol/min /ml)= (△A÷ε÷d×V 反总×10⁹)÷V 样÷T

=490×△A

ε：TNB 摩尔消光系数，13.6×10³ L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5 cm；V 反总：反应体系总体积（L）， 200μl=2×10^-4L；V 样总：提取液体积，1 ml；10⁶：1mol=1×10⁶μmol；Cpr：蛋白浓度（mg/ml）；V 样：加入上清液体积（ml），0.02 ml；W ：样品质量；T：反应时间（min），3 min。

乙酰dan碱酯酶活性测定试剂盒  P450系列