糖原磷酸化酶b（Glycogen phosphorylase b，GPb）试剂盒说明书

分光光度法 50 管/24 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

糖原磷酸化酶（Glycogen phosphorylase，GP，EC 2.4.1.1)）是糖原分解代谢的关键酶，使糖原分子从非还原端逐个断开α-1，4-糖苷键移去葡萄糖基，释放 1-磷酸葡萄糖，直至临近糖原分子α-1，6-糖苷键分支点前 4 个葡萄糖基处。GP 分为有活性的糖原磷酸化酶 a（GPa）和无活性的糖原磷酸化酶 b（GPb）两种形式。GPb 在一定浓度的腺苷酸（5，-AMP）存在下可被激活。

测定原理：

GP 催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基生成糖原和 1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖变位酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化NADP 还原生成NADPH，在 340nm 下测定NADPH 上升速率，即可反映 GP 活性。添加一定浓度的腺苷酸（5，-AMP）时测定GP（GPa 和GPb）活性，未添加腺苷酸（5，-AMP）时测定GPa活性，GP 活性－GPa 活性得到GPb 活性。

糖原磷酸化酶b试剂盒   糖原系列-常备现货

组成：

自备仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1ml 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

样本的前处理：

按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零；

2、工作液的配制：临用前将试剂二转移到试剂一中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3、试剂三的配制：临用前在试剂三瓶中加入 2.5ml 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

4、试剂四的配制：临用前在试剂四瓶中加入 2.5ml 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

5、试剂五的配制：临用前在试剂五管中加入 1.25ml 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

6、将工作液、试剂三、试剂四和试剂五置于 37℃预热 5 分钟；

7、1ml 石英比色皿中加入 50μl 样本、50μl 试剂三、50μl 试剂四、50μl 蒸馏水和 800μl 工作液，立即混匀，记录 340nm 处 5min 后的A1 和 10min 后的吸光值A2，计算ΔAGPa=A2-A1。

8、在 1ml 石英比色皿中加入 50μl 样本、50μl 试剂三、50μl 试剂四、50μl 试剂五和 800μl 工作液，立即混匀，记录 340nm 处 5min 后的A3 和 10min 后的吸光值A4，计算ΔAGP=A4-A3。

注意：由于每个样本需要同时测一个GP（GPa 和GPb）活性和一个GPa 活性，因此本试剂盒 50 管测 24

个样本。

GPb 活性计算：

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg 组织蛋白每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

GPb（nmol/min/mg prot）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=643×(ΔAGP－ ΔAGPa)÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位定义：每g 组织每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

GPb（nmol/min/g 鲜重）＝[(ΔAGP－ΔAGPa)×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=643×(ΔAGP－ΔAGPa)÷W

V 反总：反应体系总体积，1×10^-3 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径， 1cm；V 样：加入样本体积，0.05 ml；V 样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g。

糖原磷酸化酶b试剂盒   糖原系列-常备现货