ATP-柠檬酸裂解酶（ATP-citrate lyase，ACL）试剂盒说明书

分光光度法 50 管/48 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

ACL（EC4.1.3.8）是脂肪酸合成中的关键酶，其催化产生的乙酰fu酶 A 可用于脂肪酸合成和碳链延长、黄酮类物质合成、氨基酸合成等。

测定原理：

ACL 在ATP 和fu酶A 存在的情况下催化柠檬酸裂解为乙酰fu酶 A、草酰乙酸、腺苷二磷酸和磷酸盐。苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和NADH 生成苹果酸和NAD⁺，在 340nm 测定NADH 减少速率，计算 ACL 活性。

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组成：

自备仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、移液器、1ml 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水

样本的前处理：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1ml 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1） 工作液的配置，将试剂二和试剂三转移至试剂一中，充分混合溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃

（其它物种）水浴 5min；（注意：可取少量试剂一至试剂二和试剂三中，充分混匀溶解后转移至试剂一瓶中，重复 2-3 遍）；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

（2） 在 1ml 石英比色皿中加入 50μl 样本和 950μl 工作液，混匀，立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值A1和 2min20s 后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

ACL 活性计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清（浆）ACL 活力计算

单位定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

ACL（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷V 样÷T=1608×ΔA 2、组织、细菌或细胞中 ACL 活力计算

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位定义：每mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

ACL（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位定义：每g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

ACL（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=1608×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

ACL（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=3.216×ΔA

V 反总：反应体系总体积，1×10^-3 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm； V 样：加入样本体积，0.05 ml；V 样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

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