亮an酸氨基肽酶（Leucine Aminopeptidase, LAP）试剂盒说明书

微量法 100 管/96 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

LAP 是一类能水解肽链N-末端为亮an酸的酶，广泛存在于肝、肾、胰等组织中，尤其以肝脏中含量最为丰富。各类肝病患者因肝细胞损伤，血清LAP 的活性均有不同程度的升高，因此，血清 LAP 活性的检测能从不同侧面反映各种肝病的发生和发展。

测定原理：

LAP 分解L-亮an酰对硝基苯胺生成对硝基苯胺，后者在 405nm 有最大吸收峰，通过测定吸光值升高速率来计算LAP 活性。

亮an酸氨基肽酶试剂盒 氨基酸系列-常备现货

组成：

自备仪器和用品：

酶标仪/可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、96 孔板/微量石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

样品的前处理：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（ml）为 1000~5000：1 的比例（建议 2000 万细菌或细胞加入 1ml 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

LAP 测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 405nm，蒸馏水调零。

2、将试剂二转移至试剂一中充分溶解（如较难溶解，可 50℃水浴加热约 30min 促进溶解）；在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min 以上；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 50μl 样本和 150μl 试剂一，混匀后立即记录 405nm 处初始吸光值A1 和 2min 后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

注意事项：若ΔA 大于 0.5，需将酶液用提取液稀释，计算公式中乘以相应稀释倍数。使 A2-A1 小于0.5，可提高检测灵敏度。

LAP 活力单位的计算：

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清（浆）LAP 活力的计算:

单位的定义：每ml 血清（浆）每分钟生成 1 nmol 的对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷V 样÷T=205.8×ΔA 2、组织、细菌或细胞中LAP 活力的计算:

（1） 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=205.8×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算：

单位的定义：每g 组织每分钟生成 1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=205.8×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(2000×V 样÷V 样总) ÷T=0.103×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：对硝基苯胺摩尔消光系数，9.72×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.05 ml；V 样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000 万。

b. 用 96 孔板测定的计算公式如下

1、血清（浆）LAP 活力的计算:

单位的定义：每ml 血清（浆）每分钟生成 1 nmol 的对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP（nmol/min /ml）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷V 样÷T=411.5×ΔA 2、组织、细菌或细胞中LAP 活力的计算:

（1） 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷ (V 样×Cpr) ÷T=411.5×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算：

单位的定义：每g 组织每分钟生成 1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP（nmol/min /g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=411.5×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 对硝基苯胺定义为一个酶活力单位。

LAP（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(2000×V 样÷V 样总) ÷T=0.206×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：对硝基苯胺摩尔消光系数，9.72×10³ L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.05 ml；V 样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，2min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞总数，2000 万。

GOT（nmol/min/mg prot）=[（ΔA+0.0013）÷0.2384×V1]÷(V1×Cpr)÷T×10³ =209.7×（ΔA+0.0013）÷

Cpr

需要另外测定，建议使用本公司BCA 蛋白质含量测定试剂盒。

（2） 按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。

GOT（nmol/min/g 鲜重）=[（ΔA+0.0013）÷0.2384×V1]÷(W×V1÷V2)÷T×10³ =209.7×（ΔA+0.0013）÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmol 丙酮酸定义为一个酶活力单位。

GOT（nmol/min/10⁴ cell）= [（ΔA+0.0013）÷0.2384×V1]÷(500×V1÷V2)÷T×10³ =0.419×（ΔA+0.0013）

V1：加入反应体系中样本体积，0.01ml；V2：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，20 min；Cpr：

蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万；10³：1umol/ml=10³ nmol/ml。 1、标准曲线线性范围为：0.01 umol/ml -2 umol/ml。

2、ΔA 线性范围为：0.01 -1。

亮an酸氨基肽酶试剂盒 氨基酸系列-常备现货