huang嘌呤氧化酶（xanthione oxidase, XOD）试剂盒说明书

微量法 100 管/96 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

XOD（EC 1.17.3.2）催化huang嘌呤氧化生成尿酸和超氧阴离子，是活性氧主要来源之一；同时也是核苷酸代谢的关键酶之一。XOD 主要分布于哺乳动物的心，肺，肝脏等组织中，当肝功能受损时，XOD 大量释放到血清中，对肝损害的诊断具有特异性的意义。

测定原理：

XOD 催化huang嘌呤产生尿酸，尿酸在 290nm 下有特征吸收峰。

huang嘌呤氧化酶试剂盒   氧化系列

试剂组成和配制

需自备仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、研钵、冰和蒸馏水。

粗酶液提取：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1ml 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 290nm，蒸馏水调零。

2、 XOD 检测工作液的配制：用时在每瓶试剂二中加入 15ml 试剂一，充分混匀，待用；现配现用；

3、 测定前将XOD 检测工作液在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min 以上。

4、 准备 96 孔UV 板一块（非普通酶标板，普通酶标板只能透过可见光，不能透过紫外光，检测波长小于 340nm 务必使用UV 板）。

5、在微量石英比色皿或 96 孔UV 板中加入 10μl 样本和 250μl 工作液，立即混匀并计时，记录 290nm下初始吸光值A1 和 1min 后的吸光值 A2。计算ΔA＝A2-A1。

XOD 活性计算：

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清（浆）XOD 计算：

单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟催化产生 1nmol 尿酸定义为一个酶活力单位。

XOD（nmol/min/ml）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷V 样÷T=2131×ΔA 2、组织、细菌或细胞中XOD 计算：

（1） 按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmol 尿酸定义为一个酶活力单位。

XOD（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T =2131×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算：

单位的定义：每g 组织每分钟催化产生 1nmol 尿酸定义为一个酶活力单位。

XOD（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V 样÷V 样总）÷T=2131×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每一万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmol 尿酸定义为一个酶活力单位。

XOD（nmol/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V 样÷V 样总）÷T=4.26×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2.6×10^-4 L；ε：尿酸摩尔消光系数，1.22×10⁴ L/ mol /cm；d：比色皿光径， 1cm；V 样：加入样本体积，0.01 ml；V 样总：加入提取液体积，1 ml；T：反应时间，1 min；W：样本 质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；500：细胞或细菌总数，500 万。

b. 用 96 孔板测定的计算公式如下

标准条件下的回归曲线为y = 1.2396x + 0.0259，R² = 0.9977；其中 y 为△A，x 为NADPH 浓度nmol/ml 1、血清（浆）中NADPH 含量计算

NADPH 含量(nmol/ml）= [(△A -0.0259）÷1.2396×V1)] ÷(V3×V1÷V2)= 16.1× (△A -0.0259）

2、组织、细菌或细胞中NADPH 含量计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

NADPH (nmol/mg prot）=[ (△A -0.0259）÷1.2396×V1)] ÷(V1×Cpr)= 0.8× (△A -0.0259）÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

NADPH (nmol/g 鲜重）=[(△A -0.0259）÷1.2396×V1) ]÷(W×V1÷V2)=1.6× (△A -0.0259）÷W

(3) 按细菌或细胞密度计算

NADPH (nmol/10⁴ cell）=[(△A -0.0259）÷1.2396×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.003× (△A -0.0259）

V1：加入反应体系中样本体积，0.05ml；V2：加入提取液体积，2ml；V3：加入血清（浆）体积：0.1ml； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。

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