线粒体转氢酶-2（TH-2）试剂盒说明书

微量法 100 管/96 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

TH 位于线粒体的内膜上，又称为线粒体复合体六，催化NADH+NADP⁺和NAD⁺+NADPH 相互转化，调节线粒体NAD(H)和NADP(H)平衡。把逆向反应称为 TH-2，催化 NADPH 和NAD⁺生成NADP⁺和NADH。

测定原理：

NADH 和NADPH 均在 340nm 有特征吸收，因此TH 催化的转氢反应不能导致 340nm 吸光度发生变 化。用人工合成底物 3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸（APAD⁺）替代 NAD⁺，TH-2 催化APAD⁺还原生成APADH， APADH 在 375nm 有特征光吸收，测定 375nm 光吸收的增加速率，来计算 TH-2 活性。

线粒体转氢酶-2（TH-2）试剂盒 氧化磷酸化

试剂的组成和配制：

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

具体产品的参数以收到产品说明书的参数为准

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆 600g，4℃离心 5min。

3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

4、上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的TH-2（此步可选做）。

5、步骤 4 中的沉淀即为线粒体，加入 500uL 试剂二，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声3s，间隔 10 秒，重复 30 次），用于TH-2 活性测定。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 375nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1） 工作液的配制：临用前将试剂四、五转移到试剂三中混合溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃

（其它物种）水浴 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

（2） 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 20μL 样本和 180μL 工作液，混匀，立即记录 375nm 处初始吸光值A1 和 10min 后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

TH-2 活性计算：

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr)÷T=149×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每g 组织每分钟产生 1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=74.5×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.149×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：APADH 摩尔消光系数，6.7×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入提取液体积，0.5mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

b. 用 96 孔板测定的计算公式如下

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr)÷T=298×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每g 组织每分钟产生 1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=149×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol APADH 定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.298×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：APADH 摩尔消光系数，6.7×103 L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入提取液体积，0.5mL；T：反应时间，10 min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

线粒体转氢酶-2（TH-2）试剂盒 氧化磷酸化