脯an酸（PRO）含量测定试剂盒说明书

微量法 100 管/96 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定测定意义：

Pro 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，逆境条件下，植物体内Pro 含量显著增加。Pro 增加量在一定程度上反映了抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯an酸。因此，脯an酸增加量可以作为抗逆育种的生理指标之一。

测定原理：

用磺基水杨酸（SA）提取Pro，加热处理后，Pro 与酸性茚三酮溶液反应生成红色；加甲苯萃取后，在 520nm 测定吸光度。

脯an酸（PRO）含量测定试剂盒   抗逆系列

组成：

自备仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、冰乙酸 25ml、甲苯 50ml、研钵、冰和蒸馏水。

样品测定的准备：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（ml）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1ml 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；之后置 95℃水浴振荡提取 10min；10000g， 25℃离心 10min，取上清，冷却后待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1ml 提取液），匀浆；之后置 95℃水浴振荡提取 10min；10000g，25℃离心 10min，取上清，冷却后待测。

2、血清（浆）样品：按照血清（浆）体积（ml）：提取液体积(ml)为 1：5~10 的比例（建议取 0.1ml 血清（浆）加入 1ml 提取液），充分混匀，之后置 95℃水浴振荡提取 10 分钟，10000g，25℃离心 10 分钟，取上清，冷却后待测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 520nm，蒸馏水调零。

2、样本测定：

(1) 取0.25ml 样本+0.25ml 试剂一+0.25ml 试剂二 于有盖EP 管中，置 95℃水浴中保温 30min（盖紧，防止水分散失），每 10min 振荡一次。

(2) 待冷却后，加入 0.5ml 试剂三，振荡 30s，静置片刻，使色素转至试剂三中；吸取 0.2ml 上层溶液于微量石英比色皿或 96 孔板中，于 520nm 波长处比色，记录吸光值 A。

Pro 含量计算：

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、典型回归方程 y = 0.0521x - 0.0021 (x 为脯an酸含量，μg/ml；y 为吸光值A)

2、按照血清（浆）体积计算

Pro 含量(μg/ml)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V3×V1÷V2）=192×(A+0.0021)

3、按照蛋白浓度计算

Pro 含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(V1×Cpr)=19.2×(A+0.0021)÷Cpr

4、按照样本质量计算

Pro 含量(µg/g 鲜重)= [(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(W×V1÷V2)=19.2×(A+0.0021) ÷W

5、按照细菌或细胞密度计算

Pro 含量(μg/10⁴ cell)=[(A+0.0021) ÷0.0521×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0384×(A+0.0021)

V1：加入反应体系中样本体积，0.25ml；V2：加入提取液体积，1 ml；V3：加入血清（浆）体积，0.1 ml； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

b. 用 96 孔板测定的计算公式如下

1、典型回归方程 y = 0.02605x - 0.0021 (x 为脯an酸含量，μg/ml；y 为吸光值A)

2、按照血清（浆）体积计算

Pro 含量(μg/ml)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(V3×V1÷V2）=384×(A+0.0021)

3、按照蛋白浓度计算

Pro 含量(μg/mg prot)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(V1×Cpr)=38.4×(A+0.0021)÷Cpr

4、按照样本质量计算

Pro 含量(µg/g 鲜重)= [(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(W×V1÷V2)=38.4×(A+0.0021) ÷W

3、按照细菌或细胞密度计算

Pro 含量(μg/10⁴ cell)=[(A+0.0021) ÷0.02605×V1]÷(500×V1÷V2)=0.0769×(A+0.0021)

V1：加入反应体系中样本体积，0.25ml；V2：加入提取液体积，1 ml；V3：加入血清（浆）体积，0.1 ml； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

注意：zui低检测限为 1μg/ml 或 1μg /g 鲜重 或 0.01μg /mg prot

脯an酸（PRO）含量测定试剂盒   抗逆系列